氧化石墨烯新应用：抗菌性能的研究

近期，印度卡林加工业技术学院(KIIT)大学的Sasmita Nayak教授（通讯作者）课题组在Advanced Materials上发表近期工作，文章主要报道了天然虫胶衍生的氧化石墨烯包覆金属涂层制备的到的复合材料优异的抗菌性能；研究还发现，其中的抗菌活性与金属体系的电导率直接相关，电导率越高，抗菌活性越好。

【 研究背景 】

石墨烯是一种碳同素异形体，由于其独特的结构和理化性质，成为人们研究的热点，它具有二维的平面结构，碳原子为sp²杂化排列。石墨烯的衍生物——氧化石墨烯(GO)和还原氧化石墨烯(RGO)等均是生物相容性化合物，因此，目前它们在生物医学领域具有广泛的研究。GO具有类似石墨烯的结构，此外，它还可以用环氧基和羧基装饰边缘，由于其具有较高的抗拉强度和耐腐蚀性能，也因此成为优良的涂层材料。以往文献报道GO可以成功地沉积在各种表面，如棉织物，聚合物纤维，纸，也用作纳米涂料以保护底物及发挥抗菌作用，早期的研究也表明石墨烯和金属纳米粒子复合材料具有显著的抗菌性能。抗菌材料从医院到厨房台面有着各种各样应用，在病原体多药耐药的时代，抗生素的治疗一直是一个严峻的挑战，研究者们对环境友好、成本有效控制的抗菌治疗方法一直在研究探索。

【 研究方法 】

【 研究思路 】

为了推断虫胶转化为氧化石墨烯的可能性，研究者们通过拉曼测试和XPS测试分析了材料的键震动以及化合键变化。

图1a给出了直接在金属衬底上合成GO的示意图。氧化石墨烯的拉曼光谱数据表明，该光谱分别在1350，≈1600和2710 cm^-1处出现D、G和2D峰。D峰和G峰分别对应于两个碳原子在sp²杂化碳网络上的缺陷和光学模振动。2D峰是D峰的第一阶复色调，对结构缺陷和微观缺陷都非常敏感。也就是，氧官能团的存在或微结构修饰石墨烯的存在大大降低了2D峰的强度。对虫胶涂覆玻璃、钢、镍、锌和锡等材料进行加热后测试拉曼，表明虫胶碳源产sp²键合碳原子。XPS分析有助于判断连接到碳原子上的sp²碳原子以及氧官能团的类型，连接到氧官能团上的sp²碳原子的峰位置以比对应的未连接的sp²碳原子出现更高的结合能，这是因为在连接到高电子密度氧原子的同时，碳原子的电子密度会降低。此外，峰位的相对变化与所附的氧官能团的吸电子能力有关，此外，这些氧官能团也可以相互关联以了解观察结果。

图一

(a) 直接在金属衬底上合成GO的示意图；

(b) GO包覆基底表面的拉曼图谱；

(c) 石墨烯包覆纯不锈钢基底的XPS分析；

(d) XPS的C1s反褶积图谱。

为了模拟家庭和医院的细菌感染情况，研究者们在GO金属上培养细菌细胞，然后提供营养丰富的培养基促进其增长；第二天，以菌落细胞的生长形式作为抗菌活性的量度，在GO金属片上没有观察到任何菌落，除锌以外的纯金属没有观察到抑制细菌生长。而控制GO玻璃的表面显示出丰富的细胞生长（图2a）。这些结果表明，与纯金属板相比，包覆金属的GO片具有优异的抗菌活性。这可以通过GO和底物的相加效应来解释，它们共同增强了金属的抑菌/杀菌作用。研究者们在这里提出，由于细菌细胞的相互作用，在GO表面的含氧官能团可以接受来自细胞壁的电子并且产生活性氧簇（ROS）。在GO涂层金属(GO-M)表面繁殖，由于细胞壁与底物之间的电子传递会损害细菌细胞的活力，然后倒入琼脂，把细胞分散到石板上，并在一夜之间繁殖。在接触初期产生的活性氧可以通过琼脂扩散，导致后来检测到的板上生长抑制。在锌存在条件下观察到的生长抑制作用可以用类似的机制来解释。

图二 生长抑制试验

(a) GO包覆玻璃基地表面显示出丰富的细菌生长，说明其没有抗菌活性；

(b-e) 进行鉴定后在GO包覆涂层金属板上没有可见的菌落。

虽然菌落计数是预测细菌细胞生长的一种经典方法，但有时对细菌而言是可行的，但不能形成菌落，它们处于休眠状态，在适当的条件下，它们可以再生，甚至表现出致病性。在这种情况下，利用细胞染色技术分别用Syto 9染色和碘化丙酸(Pi)染色活细胞和死细胞，可以准确区分健康细胞和受损细胞。Syto 9既能染活细胞，也能染死细胞，而Pi只能染红死细胞。为了确定GO包被材料对细菌定植的抑制能力，采用活死成象试剂盒对大肠杆菌进行染色。得到与先前相一致的结果，在GO-Ni和GO-Zn上通过Pi染色检测到更多的死亡细胞；在GO钢和GO-Sn上观察到的死亡细胞数量相对较少；GO玻璃主要显示标记为绿色的Syto 9，为活的细胞。因此，研究者们可以在此提出，天然衍生的GO涂层金属板通过诱导膜损伤，对大肠杆菌细胞起着强大的杀菌平台的作用。这可能部分由于细菌壁的扰动的细胞膜的完整性，其中研究者们提出了电子的转移。结果表明GO锌和GO镍相对于GO锡和GO钢基体具有更高的杀菌活性。在之前的实验中，去玻璃系统并没有表现出任何的杀菌作用。作为比较，研究者们也利用大肠杆菌细胞暴露于纯虫胶衍生去染色（S）和没有任何衬底商业GO（C）。我们在两个GO（S）和GO（C）观察到了一些死细胞和大部分活细胞。

图三 活/死细胞图片

(a) GO玻璃上大多数细胞可以存活；

(b,c) GO钢板和GO-Sn相比于GO-Ni和GO-Zn具有更高的活细胞生存率；

(d,e) GO-Ni和GO-Zn上大多数细胞死亡。

为了更好地理解自然的抗菌涂层材料，研究者们表征了扫描电子显微镜（SEM）和场发射扫描电镜（FESEM）。选择直接接触各种基质时观察到细胞膜损伤的形态，研究者们可以看到，大肠杆菌细胞在GO-Zn样品板上遭受最严重的损伤并且细胞形态完全丧失，导致细胞膜损伤大面积爆发。GO-Ni上的细胞表现出与GO-Zn膜损伤相似的作用，导致细胞形态的改变。相对而言，在GO-Sn上仍有较多的完整细胞，但细胞膜的损伤和细胞形态的丧失是相当明显的。正如研究者们所预料的，许多完整的细胞在GO钢上有明显的膜穿孔，相比之下，对照表面玻璃表面的细胞形态基本正常且外观健康。

图四 不同GO包覆基底样品的FESEM表征

(a) GO玻璃上的细胞生长健康且细胞膜无损伤；

(b-e) 细胞在其余基底上繁殖显示出不同的细胞形态，可以观察不同细胞膜破坏程度。

金属与环境接触产生活性氧簇（ROS），为了鉴定由与GO金属和GO-玻璃系统相互作用产生的细胞内活性氧簇ROS产生，采用荧光显微法进行ROS检测分析。通过一种细胞内ROS指示剂——2’，7’-二氯荧光素-二乙酸酯(DCFH-DA，10μM)进行测试。通过将非荧光的DCFH氧化成高度荧光的2’，7’-二氯荧光素(DCF)来进行ROS产生的定量分析。研究者们可以看到由细菌与不同涂覆材料相互作用产生的细胞内会有ROS产生量的变化。当细胞暴露于GO-Sn、GO-Ni和GO-Zn等基底时观察到荧光DCF细胞指示ROS产生的；相反，在GO-钢和GO-玻璃表面上不存在ROS产生。综上所述，检测细胞在不同的基板上繁殖1小时，ROS在GO钢相对GO-Zn、GO-Ni诱导培养的持续时间较长，且杀菌活性不太有效。

图五 活性氧簇ROS产生分析

(a) 上在25℃繁殖1小时后，大肠杆菌细胞在经GO包覆表面的测试和对照(GO-玻璃)，然后用ROS指示剂DCFH-DA染料染色15分钟。I，II)在接种在GO-玻璃和GO-STEEL系统上的细胞中未发现ROS产生，如不存在荧光DCF细胞。与ROS产生相关的III-V)荧光DCF细胞有序排列，GO-Zn＞GO-Ni＞GO-Sn；

(b,c) 观察到的细胞中与ROS产生相关的细胞中观察到用于(B)、GO-金属系统和(C)的活性的所提出的分子机制。

b-i)从呼吸链上获得电子转移的细菌细胞壁的平面示意图。b-ii)在金属基底上获得的细菌细胞壁的平面示意图，导电GO-金属体系可诱导ROS产生。c-i)在玻璃基底上获得功能性呼吸途径的细菌细胞壁的扩张视图｡c-ii)在玻璃基底上获得的细菌细胞壁的扩张视图，不导电的GO-玻璃系统不能从细菌壁上提取电子并且不能诱导ROS产生｡

【 结论 】

本文是第一个研究分析了自然衍生的GO对各种金属基板能够产生优异的抗菌性能。研究者们首次提出的虫胶衍生GO金属系统对革兰氏阴性菌大肠杆菌杀菌作用的分子机制。研究结果有力地表明，GO作为一个电子泵，从细胞膜上的电荷转移到GO表面上的官能团氧，导致ROS产生。在第一步骤中，电子转移会破坏膜的完整性和细胞活力；其次，ROS介导的氧化应激损害了细菌的代谢和膜结构，最终导致细胞死亡。因此，研究者们可以得出结论，虫胶衍生的GO金属通过非氧化和ROS介导的氧化应激机制对细菌细胞发挥作用。因其成本低、易得、附着力强等优点制备以虫胶为基础的抗菌底物，在各个行业有着广泛的应用前景。本工作将促进虫胶衍生GO于各种底物上的进一步的基础和应用研究。

【 原文信息 】

Electron Transfer Directed Antibacterial Properties of Graphene Oxide on Metals. (Adv. Mater. , 2018,  DOI: 10.1002/adma.201702149)

http://onlinelibrary.wiley.com/wol1/doi/10.1002/adma.201702149/abstract

供稿丨深圳市清新电源研究院

部门丨媒体信息中心科技情报部

撰稿人丨简奈

主编丨张哲旭