人工酶协同催化不对称Michael加成反应

人工酶的开发有利于化学合成的可持续发展。人工酶的开发面临的最大挑战是如何设计催化活性位点。将非生物的催化活性位点基团（过渡金属复合物或有机催化官能团）引入蛋白质结构中是人工酶开发的重要途径，通过调控蛋白质的环境还可以提高这些引入基团的催化活性。目前有关人工酶的研究主要致力于将单一的非生物催化位点引入蛋白质中。而自然界中酶的优异活性和选择性往往来源于其多个活性位点间的协同作用。因此如何模拟自然界中的酶将多个催化中心引入蛋白质结构中显得尤为重要。

协同催化是指双分子反应中的两个底物（例如亲核和亲电试剂）同时分别被两个催化位点活化的过程。协同催化可以降低反应的HOMO-LUMO能隙，从而加速反应的进行，因此被广泛应用于均相反应中。但是与酶催化不同，由于需要将两种已活化的底物分子生成产物，这会消耗体系的熵值，因此其催化效率会被限制。那么如果将两个催化中心引入到蛋白质结构中就可以摆脱协同催化原有的限制，进而提高催化效率。

针对上述问题，格罗宁根大学Gerard Roelfes团队在Nature Catalysis上发表了题为“Synergistic catalysis in an artificial enzyme by simultaneous action of two abiological catalytic sites”的论文。这一工作设计合成了具有两个非生物催化活性位点的人工酶，且该人工酶在Michael加成反应中具有优异的活性和对映选择性。这一人工酶利用多重耐药乳酸乳球菌调节蛋白（LmrR）作为载体，结合两个活性位点，分别为基因编码的4-氨基苯丙氨酸基团（通过产生亚胺离子活化烯醛）和超分子限域的Lewis酸Cu(Ⅱ)配合物（通过烯醇化反应活化Michael供体并将其传递给具有手性面的烯醛分子）。这一研究为今后拓宽人工酶的研究范围奠定了基础。

图1 基于多重耐药乳酸乳球菌调节蛋白（LmrR）设计的人工酶。a 含有一对中央色氨酸残基的LmrR混杂结合袋。b 基于LmrR的前期工作：通过超分子自组装将Cu(Ⅱ)-phen引入LmrR孔道中用于立体选择催化Friedel–Crafts反应。c 利用非自然的苯胺催化残基作为腙合成的人工酶催化剂。d 本工作：两个活性位点（pAF残基活化烯醛分子；Cu(Ⅱ)-phen促进合成和输送烯醇亲核试剂）协同催化非对称Michael加成反应。

一、催化剂设计思路

多重耐药乳酸乳球菌调节蛋白（LmrR）是一种从乳酸乳球菌转录的小的同型二聚体调节蛋白，由于其具有的特定结构被广泛用于人工酶的载体（图1a）。LmrR在二聚体界面含有一个超大的输水腔在其中心处分别接有两个色氨酸基团（W96和W96′），这种结构有利于其通过π堆积作用键合客体分子。作者前期的工作即将非生物催化中心Cu(Ⅱ)-phen催化中心引入LmrR中，这一金属酶可以对映选择性催化吲哚共轭加成生成烯酮的反应（图1b）。另一个向蛋白质中引入催化基团的方法是通过扩展的遗传密码，也就是抑制终止密码子的方法。作者最近即利用这一方法设计合成了具有4-氨基苯丙氨酸（pAF）残基催化中心的人工酶。pAF残基中的苯胺侧链作为醛类生成腙类反应的亲核催化剂，LmrR中心的色氨酸残基可以结合底物分子（图1c）。本文中，作者设想同时利用上述两种方法将两种非生物催化位点引入蛋白质中合成具有协同催化作用的人工酶：分别将基因编码的pAF基团和超分子限域的Lewis酸Cu(Ⅱ)配合物引入LmrR中，实现Michael加成反应的协同催化。

2、催化剂性能研究

表1 LmrR_V15pAF/Cu(Ⅱ)-phen催化剂在Michael加成反应（丙烯醛作为Michael受体）中的催化性能。

作者首先通过对比实验来研究其设计的LmrR_V15pAF/Cu(Ⅱ)-phen催化剂在Michael加成反应中的性能。表1中1-3行的结果表明LmrR、V15pAF和Cu(Ⅱ)-phen三者对于该反应的进行缺一不可。将Cu(Ⅱ)-phen用Cu(NO₃)₂替代时，产物3a的ee值只有10%左右（表1，行4），这一结果表明LmrR中的色氨酸残基与Cu(Ⅱ)复合物是通过邻二氮杂菲配体互相结合的，这有利于提高反应的ee值。表1行5的结果表明LmrR_V15pAF/Cu(Ⅱ)-phen催化剂在Michael加成反应中的产率为36%，ee值高达86%。

3、催化剂性能及蛋白诱变研究

表2 Michael加成反应（丙烯醛作为Michael受体）条件的优化以及人工酶的诱变研究。

接着作者将Michael受体换为丁烯醛以引入两个手性中心，表2行4的结果表明LmrR_V15pAF/Cu(Ⅱ)-phen催化剂对于两个非对映体的ee值分别为98%和86%。由LmrR、Cu(Ⅱ)-phen与苯胺组成的催化剂对于Michael加成反应没有活性（表2行2），而使用Cu(NO₃)₂替代Cu(Ⅱ)-phen与LmrR_V15pAF组合而成的催化剂的ee值很低（表2行3），以上结果说明苯胺基团与Cu(Ⅱ)-phen的物理分离以及相对位置的精确调控对于提升反应的对映选择性十分重要。

之后作者对LmrR_V15pAF/Cu(Ⅱ)-phen催化剂进行了诱变研究。通过将Cu(Ⅱ)-phen的结合位点即中心色氨酸残基替换为丙氨酸残基得到的LmrR_V15pAF_W96A/Cu(ii)-phen催化剂其产率和ee值都有所降低，这一结果证实了Cu(Ⅱ)键合的烯醇与活化后的烯醛两者的精确位置调控对于反应的顺利进行十分重要（表2行9）。将甲硫氨酸8（M8）置于中心色氨酸的邻位在一些情况下可以提高催化活性。表2中10-13行显示的是将几种含有疏水基或带电荷侧链的氨基酸置于M8的位置后催化性能的改变。改变后的LmrR_V15pAF_M8L催化剂的活性和立体选择性均有所提高（表2行14）. 表2中6-8及16-17行的结果表明催化剂的载量降低至0.5 mol%仍然不改变反应的对映选择性，证实了不存在外消旋背景反应。

4、底物拓展研究

表3 基于LmrR人工酶催化剂在Michael加成反应中的底物拓展研究。

作者研究了LmrR_V15pAF/Cu(Ⅱ)-phen以及LmrR_V15pAF_M8L/Cu(Ⅱ)-phen两种人工酶在α,β-不饱和醛和2-酰基咪唑的Michael加成反应中的底物拓展。对于LmrR_V15pAF/Cu(Ⅱ)-phen催化剂，当不饱和醛的β位由甲基变为丙基后反应的ee值基本不变，而变为苯基后ee值变低（表3行3-4）.对甲氧基取代的2-酰基咪唑和丙烯醛或丁烯醛反应的产率和ee值均很高（表3行5-6）。对氯取代和3-噻吩取代的2-酰基咪唑这两种底物的活性和立体选择性也有很好的结果（表3行7-8）. 诱变后的催化剂LmrR_V15pAF_M8L/Cu(Ⅱ)-phen相比于LmrR_V15pAF/Cu(Ⅱ)-phen对各种底物的产率和立体选择性相似或稍高。

这一工作设计合成了具有两个非生物催化活性位点的人工酶，且该人工酶在Michael加成反应中具有优异的活性和对映选择性（>99% e.e.）。这一人工酶的载体为多重耐药乳酸乳球菌调节蛋白（LmrR），含有两个活性位点（基因编码的4-氨基苯丙氨酸基团和超分子限域的Lewis酸Cu(Ⅱ)配合物）。这一研究为今后拓宽人工酶的研究范围奠定了基础。

Synergistic catalysis in an artificial enzyme by simultaneous action of two abiological catalytic sites (Nat. Chem., DOI: 10.1038/s41929-019-0420-6)

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41929-019-0420-6

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