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盐单胞菌用于低成本P34HB的工业化中试放大生产

本文报道了下一代工业生物技术(NGIB)首次成功地用于大规模生产生物新材料P4HB,实现了开放无灭菌联系生产的新技术放大。该过程综合了发酵培养基营养组分的单、双因素定量分析,发酵副产物分析等,利用流式细胞计数法建立了盐单胞菌的发酵小试的生长数学模型,用以指导发酵过程中补料策略的设计与优化,以及毒性相关碳源γ-丁内酯的添加等。在小试生产成功后,进一步在5-m³发酵罐中实现中试放大生产,打通PHA生产的全产业链工艺。

首先,PHA是一类胞内产物,在摇瓶研究PHA的发酵生产过程中的组份及副产物分析过程中发现,OD600的检测会受到细菌数量和PHA积累量双重因素的影响。但同时,在实际发酵生产中,又不得不考虑前体γ-丁内酯的添加时间、补料切换时间、补料组成等问题。所以非常需要一个可以表征细菌实际生长趋势的数学模型去指导发酵过程控制。因此,对细菌的菌量进行定量计数分析是刻画细菌生长曲线模型的关键。


盐单胞菌用于低成本P34HB的工业化中试放大生产

图1.  盐单胞菌TD01及衍生菌株的发酵生长曲线数学模型分析

 

本论文首先比较了血球计数法和流式细胞术计数法两种统计细菌个数的方法(图1),发现流式细胞术法要比血球计数法稳定性更好,尤其在发酵后半段菌量较大的时候,血球计数法的检测数据波动非常大。因此本论文采用流式细胞术法对细菌菌数进行在线检测。在细菌菌量计数过程中,本论文首先用传统的发酵方法进行7升罐的发酵实验,为了测试发酵工艺的适用性,实验中使用了三种不同的盐单胞菌衍生菌株(TD01、TDG、TD40),分别做了1-2批次的发酵实验。所有发酵过程都对OD600和细菌菌量进行每四小时取样检测。通过生长模型拟合计算,求得盐单胞菌的生长曲线数学模型。

对于盐单胞菌生长曲线的数学模型的验证分析,本论文基于单个细胞平均体积建立了干生物量的计算模型,用以与实际发酵的细胞干生物量相比较进行验证生长曲线数学模型的准确性。首先,根据之前报道的关于盐单胞菌的电镜图可知,每个细菌可以被看做一个大小和形状相似的椭球体。而随着细菌积累了一定量的PHA,单个细菌的体积可以约等于一个圆柱体和两个半球体体积之和。根据报道中电镜图的标尺可知,该圆柱体的高度和直径约为1μm。因此,可以对单个细胞体积和单位体积(1升)发酵液的细胞总体积求和。同时,PHA的密度是1.25g/ml,而细菌的PHA积累量理论上可以无限接近100%。因此,根据实际测得的细菌菌量范围,按照100%PHA积累量来计算该发酵状态下理论最大的干生物量范围,为73.64-106.38g/L,而对应于细菌生长模型计算的对应的菌量(5.5×1010)也可以计算出理论最大的真实生物量为90.01g/L。而根据各批次发酵下罐测得的实际干生物量结果看,与计算的模型相当吻合,实际的干生物量为63-82.6g/L,其PHA含量范围约为65-75%之间。因为当细胞中PHA含量低于100%时,细菌的平均密度将低于PHA颗粒的密度,而对于相同体积的细菌量,其质量也会降低,所以实际干生物量比理论计算的最大真实生物量低10-20%也是合理的。综上所述,本论文中建立的细菌生长曲线的数学模型与干生物量的计算模型是吻合的。因此,该数学模型是可以作为理论基础指导发酵优化以获得更高的细菌干生物量和更高效的PHA发酵生产。


盐单胞菌用于低成本P34HB的工业化中试放大生产

图2.  盐单胞菌利用相关碳源和三段补料法发酵生产P34HB(7-L罐)

 

盐单胞菌用于低成本P34HB的工业化中试放大生产

图3.  5-m³发酵罐发酵生产P34HB的36小时发酵结果

 

最后,通过对盐单胞菌的生长分析,进行了底料和补料上的优化,在小试发酵结果中,利用盐单胞菌TD40生产P34HB,其干生物量超过80g/L,PHA含量达到75%,其中4HB单体的摩尔比达到12%(图2)。在添加毒性前体γ-丁内酯的情况下,发酵水平与野生型盐单胞菌TD01相比维持相当接近的水平。小试发酵生长成功后,基于几何放大法和放大法的理论计算,该工艺直接在5-m³发酵罐中进行中试放大,实现36小时发酵后干重高达100g/L,单位时间的产率提升明显(图3)。同时配合下游PHA水相提取工艺的成功开发,全产业链的PHA生产工艺尘埃落定,圆满告捷。该工作是世界上首次实现无灭菌开放的发酵生产过程,同时降低了至少30%的PHA生产成本,向“下一代工业生物技术”迈进了里程碑的一步。



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