从样品制备到实际操作,手把手教你拍出高质量TEM照片

透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)具有很高的分辨率和放大倍数高,广泛应用于材料科学、地球科学、医学和生命科学等领域。透射电子显微镜结合不同的附件(X射线能谱分析(EDS)、电子能量损失谱(EELS)),可以同时提供形貌、成分、结构信息,它可以揭示物质内部的微细观结构,是人们了解、认识事物微观结构不可缺少的工具。观察透射电镜的最终目的是得到清晰的照片,而样品的制备是关键。透射电镜样品的制备质量,直接影响到样品的观察效果与分析结果。

 

1样品制备的基本要求

 

(1)样品被观察区对入射电子必须是“透明”的。电子穿透样品的能力与其本身能量及样品所含元素的原子序数有关。一般透射电镜样品的厚度在100nm以下。对于高分辨电镜样品,厚度必须小于10nm。

 

(2)样品必须牢固。以便能经受电子束的轰击,并防止装卸过程中的机械振动而损坏。对于易碎的块状样品,必须将其粘在铜网上,铜网对样品起着加固作用。对于粉末样品,可设法将其分散在附有支持膜(如火棉胶膜、微栅膜、超薄炭膜)的铜网上,铜网及火棉胶膜对粉末样品起支撑、承载和黏附作用。生物样品则必须先固定、硬化,然后切成超薄切片,再置于覆有支持膜的载网上。

 

(3)样品必须具有导电性。对于非导电样品,应在表面喷一层很薄炭膜,以防止电荷积累而影响观察。

 

(4)防止样品被污染。在制样过程中,样品的超微结构必须得到完好的保存。应严格防止样品被污染和样品结构及性质的改变(如相变、氧化等)。

 

2样品载网与支持膜的选用

 

载网通常是一种多孔的金属片,对样品起加固和支撑作用。载网可以用Cu、Ni、Mo、Al、W、Au及尼龙等材料制作,但通常使用Cu制作,故统称铜网。它有许多不同的规格,可根据样品的性质选择使用。大多数透射电镜样品在制样时,为了确保样品能搭载在“载网”上,会在“载网”上覆一层有机膜,称为“支持膜”。这种具有支持膜的载网,称为“载网支持膜”。

 

支持膜为一层非晶质的薄膜,厚约20nm。它在电子束照射下应该是“透明的”,本身并无任何结构,且与样品不会发生反应。

 

下面具体介绍支持膜的分类。

 

2.1无孔碳支持膜系列

 

碳支持膜(Formvar Stabilized with Carbon Support Film)是在方华膜(也可用火棉胶)上再覆盖一层碳,是最常见并被广泛采用的支持膜。喷镀的碳颗粒较细,通常小于1nm,是200kV电镜下观察纳米材料的最佳选择。膜总厚度:10~20nm。

 

2.2纯碳支持膜系列

 

纯碳支持膜(Carbon Support FilmwithaRemovable Formvar Backing):适合观察10nm以上的样品。膜总厚度:20~40nm。推荐选用400目载网。

 

薄纯碳支持膜(Thinner Pure Carbon Support Film):在操作上膜总厚度:7~10nm(根据实验要求还可以更薄,达到3~7nm)。推荐选用400目载网。

 

超薄碳支持膜(Ultrathin Pure Carbon Film with no Formvar Backingon Lacey Carbon Support Film):特别适用于低衬度的高分辨电镜,并且是能量过滤(Energy Filtering TEM)检测的理想载膜。膜厚度3~5nm。推荐选用230目载网。

 

2.3有孔(微栅)支持膜系列

 

微栅支持膜(Lacey Support Film):常见孔径大约2~8μm。膜厚度15~30nm。推荐选用230目载网。

 

纯碳微栅支持膜(A Lacey Support Film with a Removable Formvar Backing):更便于微束分析或获得单颗粒电子衍射像。膜总厚度15~30nm。推荐选用230目载网。

 

FIB微栅支持膜(FIB Lacey Support Film):专用于FIB(聚焦离子束)分析技术领域。膜总厚度15~30nm。推荐选用200目载网。

 

多孔碳支持膜(Holey Support Film):膜厚度15~20nm。推荐选用230目载网。

 

Quantifoil规则多孔支持膜(Quantifoil Micromachined Holey Carbon Support Film):此种膜还可应用于物质纳米特征研究,如生物大分子复合体在载体自由悬层的研究。膜孔径的定制范围为1~7μm。膜厚度18~20nm。

 

C-flat纯碳多孔支持膜(C-flat Holey Carbon Grids for Cryo-TEM)是应用于Cryo-TEM的首选支持膜。

 

2.4非碳材料支持膜系列

 

纯方华膜(Pure Formvar Support Film Only):膜厚度10~15nm。推荐选用200目载网。

 

镀金支持膜(Formvar Stabilized with Gold Support Film):便于EDS检测。膜厚度:10~20nm。推荐选用200目载网。

 

镀锗支持膜(Formvar Stabilized with Germanium Support Film)具有化学性质稳定,衬度好等优点。

 

氮化硅薄膜窗格(Silicon Nitride Support Film)可承受1000°C以上的高温。弹性较好,适用于各种样品制备技术,在电子束轰击下比较稳定,衬度及亲水性较碳膜稍差。

 

2.5特型载网支持膜系列

 

除了我们通常使用的圆孔和方孔载网支持膜外,特殊应用时会选择一些特型载网制作的支持膜。如光圈载网,狭缝载网,双联载网等。

 

3样品制备方法

透射电镜的样品制备是一项较复杂的技术,它对能否得到好的TEM像或衍射谱是至关重要的。透射电镜是利用样品对如射电子的散射能力的差异而形成衬度,这要求制备出对电子束“透明”的样品,并要求保持高的分辨率和不失真。电子束穿透固体样品的能力主要取决加速电压,样品的厚度以及物质的原子序数。一般来说,加速电压愈高,原子序数愈低,电子束可穿透的样品厚度就愈大。对于100~200kV的透射电镜,要求样品的厚度为50~100nm,做透射电镜高分辨率,样品厚度要求约15nm(越薄越好)。

 

现将透射电子显微学最常用的几种制样方法介绍如下(更详细的可参照透射电子显微镜TEM之样品制备方法):

 

3.1粉末法

 

此法又称悬浮液法,适用于其粉末可以被电子穿透之样品的制备,如碳黑、粘土矿物等。如果粉末样品处于半固结状态,可将其放在玛瑙研钵中轻轻捣碎,然后按下面步骤制作:先将粉末样品撒入装有蒸馏水、酒精、丙酮或甘油等的容器中,用超声波震荡器将其震荡约10min,使其在液体中分散成悬浮液。再用滴管吸取悬浮液,并将1或2滴移至覆有支持膜的铜网上。用滤纸将液滴吸干,待液体完全挥发后,即可置入电镜中观察。

 

对于块状样品,也可将其捣碎,然后再按上述方法制样。必须注意的是:应该“捣碎”,而不是“研碎”,以保留尽可能多的刃边和尖角———即薄区。

 

3.2化学腐蚀法

 

此法是利用化学试剂对物质的溶解作用,以达到减薄样品的目的。通常采用适当浓度的HNO3、HCl等强酸作为化学减薄液。

 

3.3电解减薄法

 

此方法仅适用于金属和合金等具有导电性样品的制备,常使用双喷电解减薄仪来制作。该减薄仪主要由电解槽和马达箱组成。用磁力驱动,使电解液从样品两侧的喷嘴不断喷出,用以加速电解作用的进行。

 

3.4离子减薄法

 

离子减薄法既适用于导电样品,也适用于非导电样品(如半导体、陶瓷和岩矿样品等)的制备,通常用离子减薄器来完成。

 

3.5聚焦离子束

 

聚焦离子束法必须在聚焦离子束(FocusedIonBeam,缩写为FIB)系统中进行。该系统除了具有Ga离子发射装置外,还有类似于扫描电镜的二次电子信号检测及其成像系统,可以检测制样过程中Ga离子所激发出的二次电子,并使其成像。系统将Ga离子束会聚在直径只有几十nm的范围内,对样品进行轰击。通过轰击对样品进行加工和减薄。样品在遭受轰击过程中将产生二次电子,它可以被系统检测并形成二次电子像。

 

3.6超薄切片法

 

切片方法可用于生物试样的薄片制备和比较软的无机材料的切割。在用金刚石刀进行超薄切片之前,要进行包埋和用玻璃刀对其整形。对于固定试样的包埋剂可以使用丙烯基系列的树脂或环氧系列树脂。

 

这种方法比上述无机材料样品的超薄切片法复杂,但是可用于观察生物的精细结构。需要经过取材、固定、漂洗、脱水、浸透、包埋、切片及染色等多个步骤。

 

3.7冷冻制样法

 

该法采取冷冻技术使生物样品迅速干燥和硬化。

 

它的优点在于可以避免化学固定剂和脱水剂对生物组织的不利影响,减少细胞内物质的损失,使生物大分子和酶的结构及活性得到完好的保存。其缺点是可能由冰晶带来的损伤。冷冻制样法包括:冷冻固定、冷冻置换、冷冻复型。

4样品防污染措施

 

在透射电镜观察的过程中,样品污染一直是个影响高分辨成像质量的重要原因之一。样品的污染主要是由于镜筒内残留的碳氢化合物,以及吸附在样品表明的有机物,当电子束照射某一区域时,向其聚集所致。如何有效加以改善呢?

 

(1)改善样品室的真空卫生。

①达到尽可能高的真空度,一般使用要优于20μPa;

 

②不要用手去接触放入真空中样品杆的前端部分,及橡皮圈之前;

 

③样品杆长期在大气中暴露,尤其在雨季或潮湿地区,吸附在上面的有机物很难在短时间内被抽走,这样放入样品室后就会在一定程度上破坏真空度,有条件的话最好配备一个样品杆预抽机,不使用的样品杆可以先放在这里预抽保持干燥,同时有的样品杆预抽机还带有烘烤功能,这样更有利于污染物的挥发。没有的话,最好在把样品取出后再将样品杆放回样品室保持在真空状态;

 

④对于使用DP作为样品室预抽的最好不要超过10min,太长油蒸汽多少会污染一些样品;

 

⑤样品杆放入后不要马上将灯丝或电子枪隔离阀打开,因为在插入的过程中多少会人为的造成一点泄漏,即使看着真空度很好,最好再等待1~2min,等真空稳定后再观察;

 

⑥使用ACD抗污染装置,每天早上加液氮,既有利于样品室的真空卫生,又对SIP的寿命是有好处,它的有效时间是7~8h,所以不影响下午工作中午必须补充液氮。切记下班前将ACD烘烤;⑦1~3个月要将镜筒烘烤一次,一般在周末BAKE60h左右;(2)其次使用PLASMACLEANERZ(等离子清洗机)对样品进行处理。它是通过活性等离子对样品进行物理轰击与化学反应双重作用,使被清洗物表面的有机物及氧化层物质变成粒子和气态物质,经过抽真空排出,而达到清洗目的。另外它也可以作为样品预抽机使用。

 

(3)BEAMSHOWER是最为经济有效的防污染方法。

它的原理就是通过强光照射样品后,可把有机物暂时固定在样品表明,从而减少了污染率。具体步骤如下:

①LOWMAG模式,是整个铜网与大荧光屏尺寸想接近;

②TEM1-3;

③CLAP撤出位置;

④将光聚成与整个铜网相一致的大小;

⑤可加入ILAP并将光阑孔调出荧光屏外,只用一个方向的旋钮,并记住调整的方向以便后面调回。此目的是防止长时间的强光照射荧光屏,造成其老化;

⑥沐浴时间为30min;

⑦最后将ILAP光阑孔调回并撤出;

⑧返回MAG模式;

⑨注意:不是所有的样品都适合做BEAMSHOWER,只适合耐照的样品;BEAMSHOWER不是一劳永逸,功效是30min,超过这个时间要再做一次。

 

观察透射电镜的最终目的是得到清晰的照片。拍出高质量的透射电镜照片,样品的制备是关键。选择合适的制样方法,合适的载网和支持膜,并且防止样品被污染。再进行正确的电镜操作,就可以快速地拍摄出一张高质量的TEM照片。

 

5基本操作及实例展示

 

世界上有不同型号和功能的透射电镜,但是基本的操作流程都是差不多的,如图一所示。

从样品制备到实际操作,手把手教你拍出高质量TEM照片

图一 透射电镜拍摄操作基本流程

 

A.聚光镜对中:一般的透射电镜拍摄需要插入一级聚光镜光阑,刚插入时电子束可能不在荧光屏中心,如图二(a);这时需要先会聚电子束于一点,调节电子束平移至中心,再散开光斑,调节光阑旋钮使之仍在中心,反复几次后,电子束与荧光屏能同心收缩,如图(b)。

从样品制备到实际操作,手把手教你拍出高质量TEM照片

图二 (a)聚光镜光阑未对中的情况和(b)聚光镜光阑对中完成的情况

 

B.合轴:在电镜高压稳定之后,应该进行系统的合轴调整,一般情况下在alpha设为3时,平移电子束和电子枪位置,使spot size1~5的电子束都能会聚在荧光屏中心。

C.选取合适的衍射条件:很多人在拍摄晶体样品时,往往会忽略这一步,如图三中,在不同的衍射条件下,晶粒内部显现出来的微观结构会发生变化。根据晶带定律:hu+kv+lw=0,选取适当的低指数晶带轴[uvw],可以保证衍射束数目(hkl)足够多以及随后投影内势函数计算有足够的精度。由于透射电镜的衍射衬度和晶体取向也有关,所以在低指数晶带轴附近的“双光束条件”条件下拍摄,会让位错等缺陷更清晰的显现出来,以便进行统计和分析。

 

从样品制备到实际操作,手把手教你拍出高质量TEM照片

图三 轧制纯铝不同取向的晶粒内部微观结构并不一样

 

D.调焦:调整样品高度,使图像尽量清晰明锐,可以根据薄膜样品边缘出现的菲涅尔条纹(Fresnel fringes)的状态来调节物镜焦距旋钮,如图四所示。在欠焦状态下,孔洞边缘的外侧会出现呈白色的菲涅尔条纹(黄色箭头处),正焦状态下边缘平滑无菲涅尔条纹,而在过焦状态下菲涅尔条纹会在边缘内侧(黄色箭头处)。菲涅尔条纹会随着欠焦或过焦程度的增大而变宽,因此往条纹变窄的方向调节就能达到正焦状态。另外,还可以通过样品上颗粒的衬度进行调节,正焦状态下的颗粒对比度最低,看起来最平滑。值得注意的一点是,为了得到质量更好的透射照片,往往会选择在正焦状态的基础上再欠焦一点点,以增强对比度,让图片看起来更清晰。

从样品制备到实际操作,手把手教你拍出高质量TEM照片

图四 碳膜孔洞边缘在(a)欠焦(b)正焦(c)过焦状态下的拍摄图片

 

E.物镜消像散:一般物镜光阑尺寸和位置的微小变化会引起像散,如果观察的是磁性材料会干扰物镜磁场也需要消像散,对一般的材料来说,主要是在拍摄高分辨照片时才会对物镜像散有严格的要求。

 

低倍下,可以看出物镜像散会使菲涅尔条纹发生扭曲,一部分在边缘内测而另一部分在外侧,如图五所示是有物镜像散和无像散的对比。这时,可以先利用前面的方法将图像调节到欠焦或者过焦,然后调节物镜像散使菲涅尔条纹恢复均匀对称,即可消除像散。

从样品制备到实际操作,手把手教你拍出高质量TEM照片

图五 非晶碳膜孔洞在(A)欠焦(B)过焦(C)正焦(D)有物镜像散的低倍透射照片

  

高分辨模式下(100K倍甚至更高倍数),则最好需要在非晶区域进行物镜像散的调节。如图六所示,是不同条件下的非晶碳膜高分辨照片。需要先调节物镜光阑的焦距,使图像尽量清晰,对比度合适,然后进行消像散,使图一片均匀,在正焦下看起来似乎什么都没有,但欠焦和过焦图像应该很清楚,且过焦与欠焦的图像只有衬度变化,麻点的形状应一致麻点,没有方向性。这样就表明调好了。也可以利用FFT(Fast Fourier Transformation)图像来辅助调节,当FFT 图像为椭圆时表明有像散,调节至FFT 图像为正圆,说明已调好。

  

一般来说,根据麻点对比度和FFT调节物镜像散需要在100K倍以上才会有效,所以建议现在低倍下根据菲涅尔条纹调节,然后逐步升高倍数,这样才能保证物镜像散不会越调越偏。万一真的不小心调得越来越偏,感觉自己越调越差回不去了,怎么办?别急,可以在调节物镜像散的模式下,点击NTRL(复位)按钮恢复到初始状态。

从样品制备到实际操作,手把手教你拍出高质量TEM照片

图六 碳膜非晶区在(A)无像散无漂移(B)有像散(C)严重像散(D)无像散有一点漂移(E)无像散有更大的漂移(F)无像散无漂移情况下的高分辨照片和对应的FFT花样

一般来说,经过以上的逐步调节,就可以顺利的拍摄从低倍到高倍的各种透射照片了。剩下的就是调节拍照软件上的对比度和曝光时间,就能得到比较高质量的图像了。另外还有个小建议,就是在保存图片的时候最好存两种格式:拍照软件的专用格式和TIFF。选择软件专用格式是为了保存图片的所有完整信息,以备日后重新检查;TIFF相比较其他BMP、JPEG、PNG等格式而言,存储图像细微层次的信息更多,图像的质量也非常高,故而非常有利于原稿的复制。

6高分辨拍摄要点

 

高分辨电子显微像是让物镜后焦面的投射束河若干衍射通过物镜光阑,由于他们的相位相干而形成的相位衬度显微图像。由于参加成像的衍射束数量不同,得到不同名称的高分辨像。如图七中,固溶态Al-Si合金的二维晶格像,就是利用透射束加二维方向衍射束显示出来的。

 

从样品制备到实际操作,手把手教你拍出高质量TEM照片

图七 固溶态Al-Si合金的二维晶格像

 

高分辨电子显微像的拍摄是一项十分细致费时的工作,需要注意很多问题,比如:

 

(A)对含有非晶结构的膜拍摄高分辨像,应注意图像中晶区和非晶区特别是界面处的细节;含有纳米晶和非晶区的纳米晶试样,拍摄高分辨像会更容易一些。当晶区和非晶区边界细节模糊时,说明加速电压和透射电流稳定性或者工作环境稳定性有问题。此外,非晶膜的傅里叶变换花样和衍射花样的质量,可以用来判断不稳定的波数范围。

  

(B)高分辨像的质量和拍摄时的聚焦漂移与试样漂移关系极大。聚焦漂移是指聚焦随着时间推移会向着欠焦或者过焦的一侧移动的现象,如图七中(D)(E)所示。

  

(C)试样漂移一般出现在试样刚刚插入试样台的瞬间,以及刚加液氮也会产生影响,因此要测定上述两种操作之后使试样达到稳定的时间。这个时间有时甚至长达2~3min。

  

(D)确认物镜球差系数。一般可以依据厂家提供的数据,正确操作,选定最佳聚焦量,从而达到最佳的分辨率水平。

 

小结:

 

拍出高质量的透射电镜照片,样品的制备是关键。选择合适的制样方法,合适的载网和支持膜,并且防止样品被污染。再进行正确的电镜操作, 就可以快速地拍摄出一张高质量的 TEM 照片。

(来源:《浅谈高质量透射电镜照片的拍摄》)

本站非明确注明的内容,皆来自转载,本文观点不代表清新电源立场。

发表评论

登录后才能评论