作为绿色生物能源及植入型医疗、自供能传感设备的能源供给，高性能酶生物燃料电池（EBFC）的开发迫在眉睫。较低的酶负载量及酶与电极之间的直接电子传输效率是限制EBFC能量输出的关键因素。氮掺杂介孔碳纳米材料由于其良好的导电性及优异的电化学性能，是构建高性能EBFC的理想电极材料。然而，现有介孔材料较小的空隙不利于生物酶的进入，导致酶负载量低且无法介导酶活性中心电子传递。此外，基于EBFC的自供能生物传感器由于节能且易于微型化，是近年来最有前景的便携式在线生物传感器，然而，目前自供能生物传感器检测目标单一，限制了其在样品分析中的实际应用。
最近，南京大学张剑荣教授、朱俊杰教授研究团队通过微波辅助水热法，一步合成了氮掺杂大孔空心碳纳米球（pNHCSs），以pNHCSs为电极基底材料，显著提高了EBFC能量输出；最后，作者设计了双燃料驱动的EBFC，并以此为基础，开发了新型双目标分析的自供能传感器用于同时检测癌症相关的两种microRNAs，该传感器表现出优异的检测灵敏度。文章发表在国际顶级期刊Nano Energy上（影响因子：12.34）。
图1.传感器制备及运行原理图。
传感器制备流程如图1所示：以pNHCS/goldnanoparticles(AuNPs)/CP为基底电极，向电极表面滴加50 μL1.00×10-4molL-1氨基修饰的用于捕获miR-21和miR141的RNA链(Capt21和Capt141),4℃孵育过夜。通过酰胺键将Capt21和Capt141修饰到电极表面，用DEPC冲洗电极后，将20 μL 2mM MCH和1％BSA的混合物滴在电极上并在室温下孵育1小时以封闭非特异性结合位点，将Capt21，Capt141 /pNHCS/AuNPs/CP传感阳极与含有miR-21和miR-141的人血清孵育1h。然后将含有50μL 5mg mL-1分别与miR-21和miR141部分互补的RNA修饰的葡萄糖氧化酶 (GOD）和乙醇脱氢酶（ADH），Rep21-GOD和Rep141-ADH，溶液与电极孵育1h，得到完整的GOD,ADH共修饰的传感阳极。将传感阳极和胆红素氧化酶（BOD）修饰的生物阴极转移到单极室电解池组成完整的基于EBFC的自供能传感器。捕获一系列浓度的miR-21和miR-141，并记录EBFC输出并分析与目标物浓度的关系曲线。
图2.(A) pNHCS的SEM，(C) TEM图; (B) pNHCS/AuNP的SEM，(D)TEM 图; 碳纸电极(CP) (a)，pHCS/CP (b)和pNHCS/CP (c) 电极的CV(E)和LSV (F)图。N2饱和的PBS缓冲液，扫速(ν)分别为5 mV s-1(E)、1 mV s-1(F)。
pNHCSs为均一、分散性良好的空心碳纳米球。较大的空腔及表面的大孔有利于酶的进入，提高酶的负载量，同时加速传质（图1A-D）。pNHCSs的内外表面均匀覆盖着一层致密的AuNPs（图2B，D），可以保持固定化酶的活性。通过循环伏安（CV）和LSV（图2E， F）分析，pNHCS修饰的电极在0.29 V左右出现一对可逆的氧化还原峰，证明了pNHCS优异的电化学活性；此外，pNHCS可催化NADH氧化，显著降低其氧化的过电位（大约807mV），表明pNHCS具有与CoI相似的氧化还原性质（NADH脱氢酶），因此可以应用于NAD +依赖的脱氢酶的催化。阻抗图谱分析表明，通过无氮掺杂碳纳米球（pHCSs）和pNHCSs修饰后，电极的电荷转移电阻（Rct）分别从约300Ω下降到11Ω和14Ω（图3A），证明pNHCSs具有优异的电导性。
图3.(A)CP (a), pHCS/CP (b), pNHCS/CP (c),GOD/pNHCS/AuNP/CP (d), ADH/pNHCS/AuNP/CP(e)和BOD/pNHCS/AuNP/CP (f)的阻抗图谱。(B)GOD/pNHCS/AuNP/CP，(C)GOD/pHCS/AuNP/CP在不同扫速下的CV曲线。(D) pHCS/AuNP/CP (a),GOD/pHCS/AuNP/CP (b), GOD/pNHCS/AuNP/CP (c) 的极化曲线。(E) CP (a), pHCS/AuNP/CP(b), ADH/pHCS/AuNP/CP (c), pNHCS/AuNP/CP (d) and ADH/pNHCS/AuNP/CP (e) 的CV曲线。(F) pHCS/AuNP/CP (a),BOD/pHCS/AuNP/CP (b), pNHCS/AuNP/CP (c), and BOD/pNHCS/AuNP/CP (d)的CV曲线。
为了研究固定化酶与电极之间的电子传递方式及电子传递速率，以葡萄糖氧化酶(GOD)修饰的电极为例，作者记录了不同扫速下电极的CV曲线，并通过Laviron方程计算了酶的负载量及电子传递速率。如图3B所示，随着扫描速率的增加，氧化还原峰间距总小于15mV，表明GOD活性中心（即FAD）的氧化还原过程是可逆的，且氧化还原峰的对称性和稳定性优于将GOD固定在pHCS/CP电极上（图3C），证明N-掺杂可以增强酶活性中心与电极的直接电子传递(DET)。通过公式ip =n2F2νAΓ*cat/4RT计算，pNHCS/AuNP /CP电极上的GOD的表观表面覆盖率（Γ* cat）为8.65×10-10molcm-2. 根据Laviron理论计算，电子转移速率常数ks达到10.73 s-1。接着，作者考察了酶修饰的pNHCS/AuNP/CP电极对相应燃料的电催化活性。如图3D所示，对于GOD/pNHCS/AuNP/CP电极，加入5mM葡萄糖之后，在约-0.48V开始出现明显的氧化电流。同样，乙醇脱氢酶(ADH)修饰的电极可催化乙醇氧化，在0.4 V开始产生明显的催化电流（图3E）；胆红素氧化酶(BOD)/pNHCS/AuNP/CP能有效催化O2还原，还原峰在0.38 V左右。结果表明，固定在pNHCS/AuNP/CP电极上的GOD，ADH和BOD对其底物表现出优异的催化活性。
图4.(A)GOD/BODEBFC的极化曲线（黑色），功率输出曲线（蓝色）：5 (a), 10 (b), 20 (c), 40 (d),and 60 (e) mM葡萄糖.(B) ADH/BOD EBFC的极化曲线（黑色），功率输出曲线（蓝色）:10 (a), 30 (b), 60 (c), and 80(d) mM乙醇.(C) 单极室GOD/BODEBFC的开路电压(a)及最大功率输出曲线(b)。 (D) 双燃料驱动的EBFC的极化曲线（黑色），功率输出曲线（蓝色）：5 mM葡萄糖 (a), 10 mM乙醇 (b), 5 mM葡萄糖和10 mM乙醇 ( c), ν=1 mV s-1.
接着，作者以pNHCS为电极基底材料，构建了单极室EBFC，并考察电池性能。如图4A和图4B所示，GOD/BOD和ADH/BOD的功率输出随着底物浓度的增加而逐渐增加。最大功率输出密度分别达到325±0.6μWcm-2 GOD/BOD EBFC，224±0.8μW cm-2ADH/BOD EBFC。在含有40mM葡萄糖的0.1MPBS中，GOD/BOD EBFC能在空气氛围中持续运行120h，电池开路电压Eocv和最大功率输出Pmax保持稳定（图4C），证明EBFC优异的稳定性。对于双燃料驱动EBFC(图4D)，加入5mM葡萄糖之后，功率密度输出达到212±1.2μWcm-2（曲线a）;只加入10mM乙醇时，Pmax为182±0.9μWcm-2（曲线b）；同时添加5mM葡萄糖和10mM乙醇，Pmax增加至395±1.5μWcm-2（曲线c），证明EBFC可同时氧化葡萄糖和乙醇，转化为电能；三个平行的实验结果表明，氧化葡萄糖和乙醇产生的Pmax具有相加性，为双目标物的检测奠定了基础。
图5.(A) 传感器的Pmax曲线： a-c: logCmi21=logCmi141=−14.00,−12.00, −10.00. (B) △Pmax与目标物microRNA-21（实线）和microRNA-141（虚线）浓度的关系曲线。扫速ν=1 mV s-1.(C) 干扰测试：空白血清，5.00×10-12 M has-miR-125a-3p，5.00×10-12M 单碱基错配miRNA，1.00×10-14 M miR-21， 1.00×10-14M miR-141（左-右）。(D) 回收率测试：标准加入1.0×10-11M miR-21和1.0×10-12M miR-141 (a), 1.5×10-13 M miR-21和2.0×10-14M miR-141 (b), 2.0×10-14 M miR-21和5.0×10-15M miR-141 (c)的血清。
最后，作者研究了自供能传感系统对miR-21和miR-141同时检测的可行性。如图5A所示，在5mM葡萄糖条件下，传感器的最大功率输出Pmax随miR-21浓度的增加而升高，因此，可作为miR-21的信号（PmiR21,max）；接着，向同一传感系统中加入10mM乙醇后，Pmax再次升高，记录的为miR-21和miR-141的叠加信号(Psum,max)，由于此时EBFC是由葡萄糖和乙醇共同驱动。记录与不同浓度的miR-21和miR-141孵育的EBFC的PmiR21,max和Psum,max信号，发现在miR-21浓度介于10-16-10-10 M内，PmiR21,max与Cmi21呈线性关系， PmiR21,max = 7.81logCmi21 + 143.34（R2=0.9987，图5B，实线）。此外，Psum,max与PmiR21,max的差值（定义为ΔPmiR141,max），与miR-141的浓度呈线性关系，且在miR-141浓度介于10-14.5-10-10.00 M内直线相关，PmiR141,max =9.28 logCmi141 + 157.29 (R2=0.9947)，如图5B（虚线）。miR-21和miR-141的检测限分别为0.10 fM和4.0 fM.对干扰样品的测试证明了传感器优异的特异性，且实际样品测试的回收率达到97%，进一步证明了所设计传感器的可靠性。
材料制备
pNHCS的制备：首先合成粒径为300 nm左右的聚苯乙烯（PS）球：在N2气氛下，将3.2 mL苯乙烯溶于240 mL含160 L油酸的溶液中，50℃搅拌30 min后，加入140mg过二硫酸钾，60℃搅拌4h。 PS球体通过离心纯化并用水洗涤。将100mg所制备的PS分散到含1.5g葡萄糖的20mL溶液中，用25％氢氧化铵将其调节至pH =13.00。然后转移到微波管中， 180℃，180psi，200W反应20分钟。将棕色产物离心分离，洗涤，80℃烘干。产物在N2气氛下于900℃烧结，得到pNHCS。
AuNP制备：10mL38.8 mM柠檬酸钠加入到100 mL 0.04％煮沸HAuCl4溶液，并继续沸腾15分钟。
致谢部分
感谢国家自然科学基金资助（21775067,21335004）。感谢科学技术部国际合作项目的支持（2016YFE0130100）。
参考文献
Lin-Lin Wang, Hao-Hua Shao, Wen-Jing Wang, Jian-Rong Zhang ,Jun-Jie Zhu,Nitrogen-doped hollow carbon nanospheres forhigh-energy-density biofuel cells and self-powered sensing of microRNA-21 andmicroRNA-141, NanoEnergy 44(2018) 95–102
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