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提高SaCas9胞内剪切活性的方法

基因组编辑技术CRISPR/Cas9在基因功能解析,遗传病治疗,动植物微生物育种等领域得到了广泛的应用。在进行基因组编辑前,研究者往往需要根据靶位点选择基因组编辑工具。前间区序列邻近基序(Protospacer adjacent motif, PAM)在CRISPR/Cas9介导的基因编辑过程中扮演着重要的角色。然而,目前少有研究将注意力放到非典型PAM在人类细胞中对Cas9编辑活性的影响上。

为了解决这个问题,作者构建了双荧光报告系统,该系统可以用于鉴定功能性的PAM。由于SaCas9(Staphylococcus aureusCas9)编码序列较最常用的Cas9(SpCas9, Streptococcuspyogenes Cas9)小,在体内基因治疗方面具有显著性的优点,作者利用双荧光报告系统研究了非典型PAM对CRISPR/SaCas9基因编辑活性的影响。来自多个位点的结果提示SaCas9需要PAM为5′-NNGRRT-3’才能完成高效的基因组编辑。

                            

提高SaCas9胞内剪切活性的方法

 

另一方面,随着新的基因组编辑工具的出现,可供研究人员选择的基因组编辑工具也越来越多,但这也给研究者带来了选择上的困惑。为此,我们比较了SpCas9、SaCas9和FnCpf1(Francisella novicidaCpf1,最近发现在人类细胞中具有基因组编辑活性)在多个靶位点的基因编辑活性,发现SaCas9在三种基因组编辑工具中活性最高。同时利用eGFP失活实验验证了该结果。总之,本研究建立了双荧光报告系统,可用于识别基因组编辑对应的功能性的PAM,同时利用其可以比较基因组编辑工具的活性。本研究提示,SaCas9在人类细胞中比SpCas9和FnCpf1的基因组编辑活性更高。

相关论文发表在BiotechnologyJournal(DOI: 10.1002/biot.201700561)上。



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