说起冷冻电镜，小编想不管是研究生还是教授大咖，可能和科研有那么一丁点联系的人对这个名字都不会陌生，因为它实在太出名了！基于冷冻电镜产出的科研成果很多都发表在Nature、Science、Cell等顶刊上（羡慕脸），堪称NSC神器。冷冻电镜技术的发展直接带动了生命科学领域，特别是结构生物学的飞速发展，今年更是不负众望（欺负我大化学）一举拿下了“炸药”化学奖！不过，这些都不重要，毕竟他是隔壁生物家的孩子，以路人甲的姿态（羡慕但是我不表现出来）看看就好，反正也用不上！没想到一个晴朗的日子，还有些风和日丽的，Stanford的崔大神（崔屹）硬生生把它拽进了我大材料圈，而且一鸣惊人，搞了篇Science！（就问你服不服）听到这个消息，小编不禁陷入了深深的沉思，都是做材料的，怎么差别就这么大呢？（隔壁桌小林：人家是大牛！年轻的大牛！你，呵呵~）然而，短暂的沉思之后，小编知耻而后勇，决定好好看看这个“乱入”我材料圈的隔壁生物家的孩子，万一大老板某天心血来潮也弄了一台放实验室了（大老板：我就呵呵不说话），那小编岂不是有大大的优势，机智如我！独机智不如众机智，所以下面，小编带大家共同了解一下这把生物圈的屠龙宝刀——冷冻电镜！
1. 什么是冷冻电镜？
冷冻电镜，全称冷冻电子显微镜技术（Cryo-electron microscopy, Cryo-EM）（我大材料的小伙伴也快好好记住这个单词，相信不就的将来就会成为检索材料学文献的热门关键词），是指将生物大分子快速冷冻后，在低温环境下利用透射电子显微镜对样品进行成像，再经图像处理和重构计算获得样品三维结构的方法[1]。图1就是中科院生物物理研究所的FEI Titan Krios 300kV冷冻电镜，据说单台应该在600万美元以上。经过30多年的发展，冷冻电镜甚至超越了X射线晶体学、核磁共振（NMR）支撑起了高分辨率结构生物学研究的基础。
图1 FEI Titan Kiros 300kV 冷冻电镜实物图
那么为什么需要冷冻电镜技术？众所周知，X射线晶体学是解析结构的经典方法，然而它需要获得生物样品单晶，生物大分子的晶体生长却十分困难；而与此同时，材料学研究中早已使用电镜直接观察到了原子像[2]（作为一名材料汪，TEM、SEM的重要性我想无需赘言），于是生物学家也想用电镜给生物大分子拍一张高清照片，解析其结构，以理解其生化反应机制，然而事情没有那么简单，电子显微镜在生物领域的应用受到了严重限制：（1）生物样品含有丰富的水，而透射电镜的工作条件是高度真空的；（2）高能电子束会严重破坏生物样品；（3）生物样品主要是C、O、N、H等轻元素，对电子的反射和散射与背景相似，获得图像衬度很低；（4）蛋白质分子会漂移，导致图像模糊。经过众多科学家的长期努力，不断克服种种困难，冷冻电镜技术终于发展了起来，实现了溶液里生物分子高分辨率的结构解析，使得生物化学进入了一个新时代，其中3位有开创性贡献的科学家因此荣膺2017年诺贝尔化学奖。他们分别是：瑞士洛桑大学Jacques Dubochet教授、美国哥伦比亚大学Joachim Frank教授和英国剑桥大学Richard Henderson教授。冷冻电镜技术给出的生物大分子高清照相的方案是[1]：样品冷冻→低剂量电子冷冻成像→三维重构。
图2 获得2017年诺贝尔化学奖的3位科学家
（1）样品冷冻
样品冷冻其实是科学家们很早就想到的思路，但是冷冻之后样品中水分子形成冰晶，不仅产生强烈电子衍射掩盖样品信号，还会改变样品结构。直到1974年，Kenneth A. Taylor和Robert M. Glaeser在-120℃观察含水生物样品时未发现冰晶形成，而且发现冷冻样品能够耐受更大剂量和更长时间的电子辐照，才为样品冷冻带来转机。而上面提到的Jacques Dubochet老爷子则更进一步，发现了水的玻璃态，成功解决了冷冻电镜制样问题，如图3 （a）所示[1]。
图3 冷冻电镜样品制备（a）和三维重构（b）示意图
（2）低剂量电子冷冻成像
材料汪都知道一般做TEM、SEM的时候，样品导电性越好，电子剂量越高，成像质量越好。然而，高剂量电子对生物大分子却是毁灭性的，因此Richard Henderson教授提出在低温下用尽量低的电子剂量成像。他与其合作者先后在1975年和1990年重构出了粗糙的（7Å）和高分辨率（3.5Å）的细菌视紫红质蛋白的模型，如图4所示，证明了冷冻电镜用于生物大分子高分辨率结构解析的可行性。然而，这个历时15年的进步与早在1984年就获得膜蛋白3.0 Å分辨率原子模型的Hartmut Michel等人（1988年诺贝尔化学奖获得者）相比似乎仍显逊色。尽管情况不容乐观，但是Henderson教授仍不断从理论上指导冷冻电镜技术的发展并预言：随着电镜技术和制样水平的发展，冷冻电镜必将成为疑难样品和非结晶生物大分子结构解析的有力工具。
图4 细菌视紫红质蛋白的3D结构模型
（3）三维重构
做过TEM的小伙伴都知道，透射电镜得到的是二维投影图像，要得到三维的结构，就要通过一系列建模、变换，这个过程就是三维重构。上面提到的第3位诺奖得主Joachim Frank就是和他的合作者建立了非对称颗粒从二维投影到三维结构的方法（随机圆锥倾斜法），奠定了冷冻电镜单颗粒三维重构的基本原理，如图3（b）所示[3, 4]。随后，开发了SPIDER程序用于冷冻电镜结构分析，得到了广泛应用。目前，冷冻电镜领域广泛应用的三维重构软件是上面剑桥大学Richard Henderson老爷子实验室的Sjors Scheres博士（据说当时Sjors Scheres博士没有一篇NSC论文，但Richard Henderson教授仍独具慧眼将其引进到剑桥MRC分子生物学实验室）开发的RELLION。
然而，即便打通了任督二脉（上述3个关键流程），冷冻电镜并没有立即获得今天这样的爆红。这主要是因为（1）冷冻电镜的信噪比低，（2）图像摄取时漂移，使得可以获取的二维投影仍是模糊状态，因此仅能应用于有限的生物大分子单颗粒的结构解析，严重限制了其应用。直到2013年，加州大学旧金山分校（UCSF）的程亦凡教授等将直接电子探测器（DDD）用于记录冷冻电镜的单颗粒图像，大大提高了信噪比与分辨率，实现了近原子分辨率（3.3 Å）的膜蛋白结构的解析，才引起了业界的轰动，如图5所示。随后，冷冻电镜技术在生物大分子3D结构解析中无往不利，堪称屠龙宝刀。目前，美国NIH的Subramaniam实验室成功解析了谷氨酸脱氢酶的结构，分辨率达到了1.8 Å，创造了最高分辨率的世界纪录。
图5 直接电子探测器应用前后的分辨率对比
可见，正是3位诺奖科学家在各自领域内完成突破性的工作：Jacques Dubochet突破了冷冻技术的瓶颈，Joachim Frank在三维重构算法上做出了原创性贡献，Richard Henderson首次使用低电子剂量成像完成了生物大分子3D结构的解析并一直在理论上指导冷冻电镜技术的发展，最终形成了0到1的飞跃，铸造了冷冻电镜这一把屠龙宝刀，开创了结构生物学研究的新局面。上述3位科学家获得诺贝尔奖章可以说当之无愧！
2. 冷冻电镜在结构生物学中的战绩
从NSC等顶刊的发文情况及源源不断的生物大分子结构被解析出来，冷冻电镜在结构生物学领域取得的巨大成功无需赘述。单单以中国大陆为例，基于冷冻电镜技术在结构生物学领域取得的重大进展就十分可观，具体如表1所示[5]（2016年）。而随着冷冻电镜技术的大热，国内的许多高校、科研院所纷纷花重金购进冷冻电镜设备，已经有超过24家独立实验室在采用冷冻电镜进行蛋白质等生物大分子的3D结构解析研究，如图6所示[5]。
表1 2016年中国大陆基于冷冻电镜取得的标志性成果
图6 国内主要的冷冻电镜分布图
3. 冷冻电镜在材料科学中崭露头角
小编没有查到在崔屹教授之前将冷冻电镜技术应用到材料科学领域的报道，但是不管有没有，以Stanford的崔屹教授2017年10月27日在线发表在Science这篇题为“Atomic structure of sensitive battery materials and interfaces revealed by cryo-electron microscopy”的研究论文 [6]作为冷冻电镜在材料学研究中的一个开端，小编认为是合适的，毕竟它是“他山之石，可以攻玉”的一个典范，可以说开启了材料科学研究的一个新世界。
做锂电的小伙伴都知道，锂枝晶是锂电中最大的安全隐患，Samsung、Apple产品时不时出现的自燃事故和它不无关系。时至今日，枝晶的产生、生长以及刺穿隔膜造成电池内部短路，都是电池专家们不得不直面的问题，也是材料领域“持续高温”的研究方向。然而，众所周知，锂元素非常活泼，对环境极其敏感，如何从原子层面去研究锂枝晶的形成和生长，极具挑战。传统的高分辨TEM电子束能量很高，会严重损坏枝晶结构甚至熔毁；而低分辨的TEM、直接成像、表面探针等技术获得的信息又十分有限。在这篇Science论文中，崔屹教授等受“冷冻电镜可以获得脆弱的生物大分子原子级别结构”的启发，创造性地将冷冻电镜技术引入到了敏感性电池材料和界面精细结构的研究中，克服了电池材料冷冻制样的种种难题，首次获得了锂枝晶原子分辨率级别的结构图像。结果显示，冷冻电镜技术完整地保留了枝晶的原始形貌及相关结构、化学信息，在持续10min的电子束轰击下仍然保持完好。高分辨的Cryo-EM照片表明锂枝晶是呈长条状的完美六面晶体，完全迥异于传统电镜观察到的不规则形状；而其生长行为显示其有明显的<111>优先取向，生长过程中可能发生“拐弯”，但是并没有形成晶体缺陷，不影响其完美晶体结构。另外，研究结果还包含固态电解质界面（SEI）的组成与结构。崔屹教授表示，研究结果十分令人兴奋，证明了Cryo-EM可以有效地对那些脆弱、不稳定的电池材料进行高分辨率表征，例如锂硅、硫等，并且保持它们在真实电池中的原始状态。
图7 通过Cryo-EM保存和稳定锂金属
小编在查阅文献过程中，也发现了另一篇采用Cryo-EM研究锂电池的论文“New Insights on the Structure of Electrochemically Deposited Lithium Metal and Its Solid Electrolyte Interphases via Cryogenic TEM”，由美国加州大学圣地亚哥分校（UCSD）的孟颖教授（Ying Shirley Meng）等人发表在Nano Lett.上，发表时间为2017年11月1日，在线发表仅比崔教授的Science大作晚4天。文章[9]同样是采取了冷冻电镜技术稳定了电化学沉积的活泼的锂金属，同时减少电子束带来的损伤，然后对其纳米结构、化学组成以及固态电解质界面进行了研究。可以说和崔屹教授异曲同工，证明了Cryo-EM是研究对电子束、热敏感的电池材料强有力的工具，能够从最基础的层面获得相关信息。
图8 Cryo-EM用于电沉积Li金属的研究
除了上述两篇将Cryo-EM用于锂电池中敏感电池材料及SEI研究的论文外，就小编有限的认知，可能在有机/无机杂化钙钛矿材料、某些高分子材料、水凝胶、量子点等精细结构、中间态的表征中，Cryo-EM将具有的优势也是不言而喻的。可以预见，不久的将来，这些对电子束、热敏感的活泼材料的原子级别的表征可能会是Cryo-EM在材料领域应用的潜力方向。
4. 总结
2017年10月4日，诺贝尔化学奖一公布就引起了朋友圈的疯狂调侃，认为：冷冻电镜是授予物理学家的化学奖以奖励他们对生物领域的杰出贡献，让众多化学汪深以为然。现在，崔屹教授的Science论文和孟颖教授的Nano Lett.论文终于让这个化学奖多了一些化学的意思了。这种隔壁生物家的孩子“跨界”材料圈完成的令人兴奋的工作已经隐隐有撬动材料学相关研究的苗头了。小编相信，这项引领生物化学研究进入新时代的技术，搅动我大材料江湖也是指日可期！
参考文献
[1] 杨慧, 李慎涛, 薛冰. 冷冻电镜技术: 从原子尺度看生命[J]. 首都医科大学学报, 2017, 38(5): 770-776.
[2] 柳正, 张景强. 结构生物学研究方法的重大突破——电子直接探测相机在冷冻电镜中的应用[J]. 生物物理学报, 2014, 30(6): 405-415.
[3] 尹长城. 君欲善其事，必先利其器！——2017年诺贝尔化学奖评介[J]. 中国生物化学与分子生物学报, 2017, 33(10): 979-984.
[4] Milne J L S, Borgnia M J, Bartesaghi A, et al. Cryo-electron microscopy-a primer for the non-microscopist[J]. FEBS Journal, 2013, 280: 28-45.
[5] Wang H, Lei J, Shi Y. Biological cryo-electron microscopy in China[J]. Protein Science, 2017, 26: 16-31.
[6] Li Y, Li Y, Pei A, et al. Atomic structure of sensitive battery materials and interfaces revealed by cryo-electron microscopy[J]. Science, 2017, 358: 506-510.
[7] 材料牛: 崔屹最新science:玩转冷冻电镜——揭密电池材料和界面原子结构，http://www.cailiaoniu.com/108826.html.
[8] X-MOL: 化学诺奖冷冻电镜再放异彩，崔屹团队带来重磅Science，http://www.x-mol.com:8081/news/9696.
[9] Wang X, Zhang M, Alvarado J, et al. New Insights on the Structure of Electrochemically Deposited Lithium Metal and Its Solid Electrolyte Interphases via Cryogenic TEM[J]. Nano Letter, 2017, 17: 7606-7612.
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