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南京农大万群教授 ACS Catalysis:中子衍射晶体结构揭示糖苷水解酶质子的动态穿梭

通过高分辨率的X-光和中子衍射晶体学方法,结合全原子分子动力学模拟,发现谷氨酸的催化活性受到不同酸碱度的调节:在酸性条件下,其侧链处于向下位置,并从水分子中获得质子;在碱性条件下,其氨基酸侧链旋转56度,处于向上位置,并提供质子完成催化;在最适酸碱度环境,该氨基酸侧链的旋转活性达到最大,从而达到最高的催化活性。

研究背景

糖苷水解酶有一百多个家族成员,在自然界中广泛存在。糖苷酶高效地断裂多糖或寡糖中的糖苷键,每年在环境中可以降解几十亿吨的碳水化合物,在造纸、食品、饲料、生物能源等方面都有大量的应用。同时,糖苷酶也是一些抗生素、病毒抑制剂和糖尿病的靶蛋白。了解糖苷酶的作用机理,对于改造得到耐高温、耐酸碱的工业酶和设计新型的药物分子,具有理论指导意义。

糖苷酶通过广义的酸碱催化来断裂糖苷键,酶蛋白活性中心的一个谷氨酸侧链作为广义的碱从水分子获得一个质子后,再转换角色成为广义的酸,将这个质子提供给糖苷键中的氧原子,从而断裂糖苷键

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研究成果

南京农业大学万群课题组通过高分辨率的X-光和中子衍射晶体学方法,结合全原子分子动力学模拟,发现谷氨酸的催化活性受到不同酸碱度的调节:在酸性条件下,其侧链处于向下位置,并从水分子中获得质子;在碱性条件下,其氨基酸侧链旋转56度,处于向上位置,并提供质子完成催化;在最适酸碱度环境,该氨基酸侧链的旋转活性达到最大,从而达到最高的催化活性。

晶体的中子衍射可以直接观测到晶体中蛋白质、配体、水等各个组分的质子化状态,在研究酶催化机理中具有独特的优势。万群教授课题组在国内首次利用中子衍射技术直接观测到糖苷酶催化过程中质子的动态穿梭,该成果对于深入研究糖苷酶的催化反应机理提供了实验和理论基础(ACS Catal., 2018, 8, 8058–8069,DOI: 10.1021/acscatal.8b01472)。

图文解读

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图1. Xyn II结构

论文研究对象Xyn II为里氏木霉分泌的内切-1,4-木聚糖酶,属于GH 11家族,最适pH为5~5.5。Xyn II为一个像闭合的右手一样的果冻卷结构。Xyn II为一个像闭合的右手一样的果冻卷结构,青色区域像手的拇指,黄色区域像手指,灰色区域像手掌,催化氨基酸为E86和E177,活性中心部位结合的底物为木六糖。在该结构中,-1位的木糖构型从4C1扭转为0E构型,然而QM/MM分子动力学表明,0E构型可能由于酰胺的替代造成假象。为了解决这个问题,我们获得了野生型Xyn II与水解产物三糖(X3)的结构。Cremer-Pople软件分析结果显示,-1位的木糖具有4C14H3之间的过渡构型,-2、-3位的木糖构型接近4C1。而E177Q-X6结构中-1位木糖有着4C10E间的构型,其他木糖有着4C1构型。

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图2. WT-X3、WT apo、和E177-X6结构比较

WT-X3结构中,三糖占据-1-2,和-3区域,和WT apo相比,总体来说非常相似,主要变化在图2.A中品红色区域,其活性中心氢键相互作用如图2.B2.C所示。与E177Q-X6结构相比,WT-X3结构由于缺少+1+3位的木糖,P68Y96等残基远离了活性位点,E177E86没有大的构象改变。在WT-X3结构中,E177OE2原子与-1位木糖的O4A原子形成一个距离2.5 Å的氢键,而E177Q-X6结构中Q177NE2原子与-1位木糖的O4A原子形成一个距离2.9 Å的氢键。在WT-X3结构中,E177的OE1原子与Y88的酚氧原子形成一个距离2.7 Å的氢键,该距离与WT apo结构和E177-X6结构中的相同。在WT-X3结构中,E86的OE1原子与-1位木糖的O2B原子形成一个距离2.9 Å的氢键,这个距离和E177-X6结构中的一样。WT apo、WT-X3和E177Q-X6结构中E86的OE2原子和Y77的酚氧原子形成是2.6 Å的氢键。

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图3. WT和Y77F结构比较

在没有配体时,Y77F和WT的晶体结构很像,没有显著变化。Y77F仍具有催化活性,但其活性比野生型低5000倍。Y77F-X3和Y77F结构相比,“拇指”,“手指”与部分“手掌”区域朝木三糖移动,这点与WT-X3和WT的构象变化一致。Y77F-X3和WT-X3结构相比几乎是相同的。在活性位点,酚羟基的缺失使得F77的OE2原子无法与E86的O2B原子和-2位木糖的O2B原子形成氢键。此外,-1位的木糖不与E86的OE1原子形成氢键。以上氢键的缺失,使-1,-2和-3位的木糖具有4C1构型。

南京农大万群教授 ACS Catalysis | 中子衍射晶体结构揭示糖苷水解酶质子的动态穿梭图4. WT和Y88F结构比较

在没有配体时,Y88F和WT晶体结构很像。Y88F apo结构中,E177与Y88F间不行成氢键,因此,E177有一种不同的旋转构象,并且F88侧链远离了E177。E86的OE2原子和Y77羟基间的氢键距离为2.5 Å,和WT结构相似。突变体Y88F的活性比野生型下降了400倍,Y88F-X3与Y88F apo相比,变化与WT-X3和WT apo、Y77F-X3和Y77F apo非常类似,表明Y88突变为F不会导致大的构象变化。Y88F-X3结构中,Y77的羟基氧原子和E86的OE2原子形成2.5 Å的氢键,与-2位木糖的O2B原子形成一个2.9 Å的氢键,-1位木糖的O2B原子和E86的OE1原子形成一个2.8 Å的氢键。这三个氢键和WT-X3结构相似。YF88不与E177形成氢键。-1位木糖坐标不同,分别于E86的OE2原子和E177的OE1原子形成氢键。Cremer-Pople分析结果表明,Y88F-X3结构中的-1位木糖具有4C14H3之间的过渡构型。-2和-3位木糖间的相互作用和活性位残基之间的相互作用与WT-X3结构相似,有着4C1的低能构型。

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图5.CpHMD模拟E177侧链不同pH下的构象变化

CpHMD模拟给出了E177在不同pH环境的构象平衡下的宏观pKa。E177的宏观pKa计算值为5.6,接近Xyn II的最适pH范围。根据滴定曲线,E177在pH 3.5时开始去质子化,在pH 8.0时滴定完成。我们通过计算E177侧链形成的二面角来研究构象变化和pH变化的关系。通过CpHMD模拟,我们发现E177在低pH值时发生质子化,以向下构象为主。当pH增加时,向下的构象较少,最终在pH 8 时消失,同时向上的构象增加,并在高pH下占主导地位。我们的计算结果和中子晶体学结构结果吻合得很好。

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图6. WT apo中子晶体结构

我们通过气相平衡法得到pD 5.4条件下Xyn II 的中子衍射晶体结构。在pD 5.4条件下,Y88酚羟基的氘原子与E177的OE1原子形成一个2.2 Å的氢键,而pD 6.2条件下,这个距离缩小为1.9 Å,pD 8.9条件下,这个距离进一步缩小到1.5 Å 。在pD 8.9条件下,这个质子离E177的OE1原子与Y88酚羟基氧原子距离相同,形成了一个强的低势垒氢键(lowbarrier H-bond)。在pD 4.8条件下,E177是一种向下的构象,并作为广义的碱从附近水分子获得一个质子。结果表明,E188和Y88之间的氢键在碱性条件下稳定,在中性条件下变弱,在酸性条件下断裂。

总结

课题组高分辨率X光衍射晶体结构表明,GH 11木聚糖酶催化过程中木糖环构象变化为1S3®4H3®4C1 ,这和QM/MM计算结果一致。我们木聚糖酶突变体中-1位点糖环的不同构象表明,糖环柔韧性对打破糖苷键起重要作用。

结合不同pH条件下的中子衍射晶体结构,我们提出E177先作为广义的碱,其侧链选择向下,从溶液中获得一个质子,再作为广义的酸,向上旋转提供质子来断裂糖苷键。我们的CpHMD结果表明,在pD 5.6E177侧链旋转和质子转递的效率达到最高,接近XynII的最适反应pH。这些结果解释了糖苷水解酶的pH调节机制,有助于通过蛋白质工程调节其最适反应pH值。(指导老师:万群教授)

 

作者介绍

万群,南京农业大学理学院教授、博士生导师(物理系生物物理方向和化学系天然药物化学方向)。2008年博士毕业于美国佛蒙特大学分子生理与生物物理专业,曾在美国能源部橡树岭国家实验室、美国凯斯西储大学药理系从事博士后的研究工作,后在上海美迪西生物制药有限公司担任药物开发部主任,2015年作为高层次人才引进到南京农业大学理学院工作。在PNAS、ACSCatalysis、Structure、JBC、JMB等杂志发表多篇论文。为J.Struct Biol,、Acta Cryst Sect D、Plons One、Sci Rep等SCI杂志审稿人。

 

欢迎报考博士和硕士研究生:

(1)生物物理方向(物理系),硕士研究生考试科目:英语、政治、化学综合(包括有机和无机化学)或数学、生物化学或物理

(2)天然产物化学方向(化学系),硕士研究生考试科目:英语、政治、无机和分析化学、有机化学

 

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